TERAPIE CHE RIDUCONO LA QUANTITÀ DI HUNTINGTINA ANOMALA PRODOTTA: COSA BOLLE IN PENTOLA.

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All’ultimo congresso mondiale sulla Malattia di Huntington, che si è tenuto in settembre a Rio de Janeiro, Brasile, il Prof. Douglas MacDonald ha fatto il punto sulla ricerca di terapie per impedire, almeno parzialmente, al gene dell’huntingtina di produrre la proteina anomala. Si tratta di terapie che promettono di affrontare il problema della malattia alla radice e che hanno quindi maggiori probabilità di successo di quelle che invece cercano di modificare i molteplici effetti della huntingtina mutata.

Il principio basilare che governa la possibilità di modulare la quantità di huntingtina prodotta, è già stato descritto in passato su questo giornalino (vedi Box 1). Ma se esiste un principio basilare comune in questo tipo di terapie, le strategie in sperimentazione possono differire a seconda del tipo di molecole utilizzate (DNA, RNA o proteine) e delle modalità utilizzate per fare entrare le molecole nelle cellule nervose (nude, uso di vettori virali, nanoparticelle). Diverse sono anche le modalità per veicolare le molecole in studio nelle regioni cerebrali di interesse superando la barriera ematoencefalica. Infatti una delle difficoltà nel far arrivare farmaci a livello cerebrale è costituita dal fatto che i capillari cerebrali, a differenza di quelli di altre parti dell’organismo, hanno una parete difficilmente attraversabile da parte di molecole di una certa grandezza. Questo costituisce una difesa dell’integrità delle cellule nervose nei confronti di eventuali sostanze nocive che possono essere trasportate dal sangue, ma anche un impedimento a diffondere a livello cerebrale delle sostanze benefiche introdotte per bocca o per iniezioni intramuscolari o endovenose. Alcuni hanno iniettato le molecole in studio direttamente nella specifica regione del cervello che si vuole raggiungere – il corpo striato nel caso della M. di Huntington – ottenendo però un silenziamento del gene solo in quella regione, mentre nella Malattia di Huntington tutto il cervello subisce gli effetti della huntingtina mutata, con una riduzione complessiva di volume che arriva al 30%, e quindi c’è l’esigenza di far arrivare la terapia anche ad altre parti del cervello. Altri hanno sperimentato l’introduzione nel cervello di una cannula attraverso la quale si perfonde una soluzione contenente le molecole in studio che cosi arrivano in una specifica regione cerebrale, ma anche nelle zone vicine. Altri ancora hanno introdotto la soluzione nel liquor (il liquido che circola nel cervello), attraverso una tecnica simile alla puntura lombare, ottenendo in questo caso una diffusione del prodotto in tutte le aree cerebrali anche se con diversa concentrazione. Bisogna capire a questo punto quale è il sistema migliore per una sperimentazione su pazienti umani, che hanno una massa cerebrale assai più ampia dei modelli animali.

Un ultimo problema riguarda infine i metodi usati per valutare se si sono avuti effetti benefici dalla terapia. Negli animali da esperimento e particolarmente nei topi che hanno un ciclo vitale breve è possibile monitorare entro termini ragionevoli di tempo dalla somministrazione sia i miglioramenti dei sintomi e/o il rallentamento della progressione della malattia, sia la diffusione del prodotto e i suoi effetti a livello cerebrale, sacrificando gli animali. Nella specie umana il problema si presenta più complesso essendo il ciclo vitale e il decorso della malattia assai più lungo, cosa che può richiedere anni per poter apprezzare un eventuale effetto benefico sui sintomi e sulla progressione della malattia, e inoltre non potendo accedere al cervello per valutare la diffusione del prodotto nelle diverse regioni cerebrali e l’efficacia del trattamento a livello di cellule nervose. Una cospicua parte degli studi sono quindi rivolti a trovare dosaggi di sostanze del sangue o immagini cerebrali (ad es. di Risonanza Magnetica Nucleare) che permettano di avere un feedback rapido ed efficiente degli effetti della terapia.

 

Interferenza con RNA sperimentata su scimmie

In passato, era già stata sperimentata l’introduzione nel cervello di topi affetti dalla malattia di piccole molecole di RNA (small interfering RNA, o siRNA) appositamente ingegnerizzate per formare un doppio filamento con l’RNA dell’huntingtina, e legate a virus inattivati. Questo procedimento aveva dato buoni risultati in termini di recupero delle funzioni perdute e di blocco della progressione della malattia. Stiles e altri della Meditronic, MN USA, (azienda leader nel campo delle tecnologie biomediche) hanno utilizzato le stesse molecole su scimmie (primati non umani), che hanno una massa cerebrale notevolmente più grande di quella di un topo e quindi più vicina a quella umana. Queste molecole sono state perfuse, mediante una cannula attaccata ad una pompa, per 7 giorni nella regione cerebrale, detta putamen, e ne è risultata una riduzione della huntingtina nelle regioni limitrofe al punto di perfusione. I buoni risultati ottenuti fanno ritenere che la tecnica utilizzata per la introduzione delle molecole possa essere utilizzata anche nella specie umana.

 

Ridurre la produzione della sola huntingtina mutata

Uno dei problemi da affrontare con l’uso di piccole molecole di RNA e DNA è che queste riducono la formazione tanto della huntingtina normale quanto di quella mutata. Bisogna quindi trovare un equilibrio tra gli effetti auspicabili dovuti alla riduzione della huntingtina tossica e la possibilità di effetti indesiderati dovuti alla riduzione della huntingtina normale. Una via alternativa assai interessante è stata proposta dalla Sangamo Biosciences, California USA, che si basa sull’uso di una proteina con una sequenza zincfinger (a dito di zinco). Queste sequenze hanno la proprietà di legare il DNA e possono essere ingegnerizzate in modo da legare specifiche regioni del DNA. Ora i ricercatori della Sangamo (azienda californiana dedicata allo sviluppo di terapie basate sulla regolazione e modificazione genica) hanno messo a punto una proteina zinc-finger che si lega preferenzialmente alle sequenze lunghe di triplette CAG, appunto quelle del gene mutato piuttosto che a quelle corte che caratterizzano il gene normale. Questa proteina zinc-finger è associata ad un’altra proteina che impedisce la trascrizione del gene. Veicolando questo complesso proteico mediante un virus inattivato dentro cellule di pazienti Huntington coltivate in laboratorio si è ottenuta una riduzione del 90% della huntingtina mutata e del solo 10% di quella normale. Siamo ancora ad un livello iniziale della ricerca  su questo metodo assai promettente che dovrà successivamente essere provato su modelli animali della malattia e poi sperimentato nella specie umana qualora i buoni risultati ottenuti in laboratorio fossero confermati.

 

È prevista per la fine del 2014 la sperimentazione iniziale del metodo ASO su pazienti

 

Nel giornalino AICH-Roma dell’Agosto 2012 erano stati riportati (articolo intitolato: ‘Un trattamento singolo produce risultati a lungo termine in modelli animali’) i risultati ottenuti da Kordasiewicz e collaboratori perfondendo nel liquor di topi transgenici piccole molecole di DNA dette piccoli oligonucleotidi antisenso (antisense small oligonucleotide o ASO) che impediscono al gene sia normale che mutato di produrre huntingtina. La ricerca ha fornito i seguenti risultati: 1) il trattamento durato pochi giorni ha prodotto una riduzione della huntingtina mutata che è durata 2-3 mesi, e – cosa più importante – ha prodotto una remissione dei sintomi della malattia durata 6 mesi; 2) i risultati benefici sono risultati indipendenti dalla riduzione o meno della huntingtina normale, vale a dire che i benefici si sono ottenuti in egual misura sia nei topi in cui era stata silenziata la huntingtina normale e quella mutata, sia nei topi in cui era stata silenziata la sola huntingtina mutata (resa distinguibile da quella normale in questi animali); 3) la terapia blocca la riduzione di volume del cervello degli animali in esperimento per tempi relativamente lunghi; 4) le molecole utilizzate e il metodo di perfusione hanno ridotto la huntingtina anche nelle scimmie che hanno un cervello assai più grande di quello dei topi.

Dopo questi incoraggianti risultati la ISIS Pahramaceutical Inc. (che ha ingegnerizzato le molecole ASO) ha fatto un accordo con la Roche Neurosciences che ha trovato un sistema per veicolare sostanze per uso terapeutico attraverso la barriera ematoencefalica. È stata infatti messa a punto una sorta di ‘navetta’ che, senza bisogno di introdurre il farmaco direttamente nel cervello, lo trasporta attraverso la barriera ematoencefalica. Questo consente di somministrare con metodi tradizionali trattamenti che, non superando la barriera ematoencefalica, avrebbero dovuto essere introdotti direttamente nel sistema nervoso centrale, come abbiamo visto negli esperimenti sopra descritti. La unione della navetta Roche con le molecole ASO della ISIS sarà sperimentata nei pazienti Huntington a partire dalla fine del 2014.

 

La sperimentazione umana di queste nuove terapie richiede la messa a punto di sistemi rapidi ed accurati per controllarne l’efficacia

Se nei prossimi anni verrà iniziata la sperimentazione umana delle terapie sopra descritte, bisognerà cercare dei sistemi efficienti per poter controllare i loro effetti. Per risolvere il problema si sta cercando di valutare se sia possibile misurare la quantità di huntingtina mutata nel liquor ottenuto da una puntura lombare. Per massimizzare la possibilità di effettuare un dosaggio accurato la IRBM Promidis in Italia usa uno speciale apparecchio detto Erenna Immunoassay System della Singulex particolarmente sensibile e preciso. I primi risultati ottenuti sembrano confermare che effettivamente la HTT mutata possa essere dosata nel liquor. La conferma di questi risultati fornirebbe un sistema relativamente rapido per monitorare la quantità di HTT prodotta e quindi l’efficacia di una terapia che miri a ridurla. Naturalmente sarà necessario sapere in che rapporto sia la concentrazione di HTT nel liquor con quella prodotta nei diversi centri cerebrali, in altri termini se la HTT del liquor sia uno specchio fedele di quello che accade nelle cellule.

Una seconda possibilità consiste nel valutare attraverso tecniche radiologiche, come la tomografia ad emissione di positroni (PET), la quantità di recettori D2 della dopamina. I recettori sono particolari strutture delle cellule nervose che reagiscono quando vengono in contatto con un neurotrasmettitore, come la dopamina. Nei pazienti Huntington i recettori D2 della dopamina subiscono una progressiva diminuzione, in conseguenza della morte delle cellule che li possiedono. Ora al Karolinska Insitutet in Svezia si sta mettendo a punto un sistema che prevede la somministrazione di una sostanza radioattiva che si lega ai recettori D2 e che può essere visualizzata in immagini. Questo permette di valutare se la progressiva perdita di recettori D2 venga arrestata o diminuita dalla terapia in studio.

Un ulteriore progetto mira a dosare nel sangue dei pazienti una serie di proteine che hanno dosaggi diversi nei pazienti Huntington rispetto agli individui normali, in quanto la HTT mutata tende ad alterarne il meccanismo di produzione. Esistono adesso sistemi accurati per dosare più proteine contemporaneamente e la ricerca mira ad identificare quelle proteine il cui dosaggio sia alterato solo in conseguenza della produzione di huntingtina mutata e non da altri fattori contingenti.

 

CONCLUSIONI

La pentola come si vede sta bollendo e promette di cucinare cose buone, anche se non possiamo prevedere quando saranno pronte. Tuttavia cominciamo ad avere almeno delle date su quando inizierà la sperimentazione nella specie umana, invece di avere solo i risultati sui modelli animali, senza poter prevedere il loro trasferimento al letto del malato. Nel contempo la messa a punto degli strumenti che serviranno a capire in pazienti Huntington quali terapie siano efficaci e quali no dovrebbe permettere tempi relativamente rapidi di valutazione. Infine la rete ENROLL-HD che dovrebbe mettere insieme alcune diecine di migliaia di pazienti, permetterà la sperimentazione contemporanea di terapie diverse. Questo peraltro non vuol dire che la terapia che blocca, previene o rallenta la malattia sia dietro l’angolo, ma che siamo finalmente su una strada a percorrenza veloce.

 

“…non vuol dire che la terapia che blocca, previene o rallenta la malattia sia dietro l’angolo, ma che siamo finalmente su una strada a percorrenza veloce…”

 

M. FRONTALI – Istituto di Farmacologia Traslazionale CNR, Roma



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